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使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器的三個(gè)tip

更新時(shí)間:2023-06-29  |  點(diǎn)擊率:837

使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器的三個(gè)tip

市場(chǎng)上近幾年涌現(xiàn)出不少自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器。這種儀器利用光學(xué)顯微鏡技術(shù),但帶來了更高的準(zhǔn)確性、重復(fù)性,并將這一單調(diào)的工作自動(dòng)化。樣品體積小也是這種細(xì)胞計(jì)數(shù)器的額外優(yōu)勢(shì)。許多儀器使用一次性的玻片,只需要10-20 uL樣品。將玻片插入自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器中,照相機(jī)捕獲圖像。隨后內(nèi)置的軟件分析圖像,顯示細(xì)胞數(shù)量等信息。
在此,專家介紹了使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器的三個(gè)tip。
準(zhǔn)確對(duì)焦
與其他光學(xué)顯微鏡一樣,儀器的準(zhǔn)確對(duì)焦對(duì)于計(jì)數(shù)很關(guān)鍵。在手動(dòng)計(jì)數(shù)時(shí),訓(xùn)練有素的大腦可輕松鑒定細(xì)胞。然而,自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器內(nèi)的照相機(jī)檢測(cè)活細(xì)胞的亮中心和暗邊緣,將其處理成黑白像素信息。如果細(xì)胞未準(zhǔn)確對(duì)焦,那么亮中心將有明顯的灰度,會(huì)被誤認(rèn)為是死細(xì)胞。
大部分研究人員將會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)焦并不難,只要顯示在屏幕上的圖像質(zhì)量與傳統(tǒng)的顯微鏡相似。確保你有一張清晰的圖像,這很重要。另一點(diǎn)是要了解細(xì)胞計(jì)數(shù)器中照相機(jī)的分辨率。如果自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器以低的幀速顯示,如每秒小于15幀,那么顯示的圖像將不能實(shí)時(shí)響應(yīng)聚焦旋鈕的微調(diào)。
控制玻片之間的差異
大部分基于圖像的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器都使用一次性的玻片,其上有明確的測(cè)量區(qū)域。這一測(cè)量區(qū)域被物鏡的放大率和照相機(jī)的圖像傳感器大小所設(shè)定。這些細(xì)胞計(jì)數(shù)器通常測(cè)定0.4-0.5 uL樣品,相當(dāng)于血球計(jì)數(shù)器的4-5個(gè)大方格。
與血球計(jì)數(shù)器不同,計(jì)數(shù)玻片通常只使用一次。因此,玻片之間的差異會(huì)顯著影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果。對(duì)于某一組實(shí)驗(yàn),好使用同一批號(hào)的玻片,盡量避免這些差異。在更換批號(hào)時(shí),也建議用標(biāo)準(zhǔn)的微珠來檢驗(yàn)玻片。大部分細(xì)胞計(jì)數(shù)器制造商都提供已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)微珠。使用相同的微珠樣品來檢驗(yàn)不同的玻片,將有助于發(fā)現(xiàn)差異。
評(píng)估軟件的分簇性能
自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器的核心是開展分析的軟件,它相當(dāng)于手動(dòng)計(jì)數(shù)時(shí)的人腦。大部分的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器包含集成軟件,能準(zhǔn)確地計(jì)算單細(xì)胞群體的數(shù)量。然而,在談到成簇細(xì)胞的計(jì)數(shù)時(shí),細(xì)胞計(jì)數(shù)器就會(huì)存在明顯差異。由于從培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的樣品并不總是單細(xì)胞群體,因此,有時(shí)會(huì)有多個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊,而自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器的分簇(declustering)性能也仔細(xì)評(píng)估。評(píng)估分簇性能時(shí)可開展圖1的檢測(cè)。
圖1. 將HL-60細(xì)胞加熱到70°C,處理20分鐘,殺死細(xì)胞,獲得死細(xì)胞樣品。隨后利用兩款不同的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行樣品的檢測(cè)。在細(xì)胞計(jì)數(shù)之后,根據(jù)軟件捕獲的圖像進(jìn)行比較。紅色圓圈:死細(xì)胞;藍(lán)色圓圈:活細(xì)胞;黑色圓圈:排除的對(duì)象。
自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器正在取代單調(diào)乏味的手動(dòng)計(jì)數(shù)方法。隨著對(duì)一些基本原理的了解,自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器將幫助你獲得佳的結(jié)果。

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